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酮通颗粒的质量控制标准实验研究
2009-12-28
                                         刘田云1 ,余晓东1,武夏明2 ,刘逢芹1
(1 山东大学附属千佛山医院,济南 2500142 山东大学药学院,济南 250012)
 
[摘要] 目的 :探讨酮通颗粒的质量控制方法,建立该制剂的质量标准。方法:采用TLC法鉴别制剂中三七、银杏叶、葛根药材;HPLC法测定制剂中银杏总黄酮醇苷含量色谱条件为C18色谱柱,甲醇-0.4% H3PO4(55:45)为流动相,检测波长为360 nm。结果:薄层法鉴别制剂中的三七、银杏叶、葛根药材,斑点清楚,操作简便,专属性强;HPLC法测定制剂中槲皮素、山奈素、异鼠李素图谱清晰,成份分离完全,标准曲线范围内线性关系良好。结论:该方法可靠,重现性较好,可有效控制酮通颗粒的内在质量。
[关键词]:HPLC,银杏叶总黄酮醇苷,三七,葛根
 
Study on the Quality Standard for Tongtong Granule
Yu xiaodong1,Wu Xiaming2,Liu Tianyun1,Zhao Guangcheng2,Liu Fengqin1
(1Qian fo shan hospital affiliated to Shandong University,Jinan,250014; 2Pharmacy School of Shandong University ,jinan,250012)
 
ABSTRACT OBJECTIVE: To discuss the quality control methods of Tongtong   Granule and establish the quality standard for it. METHODS:Radix Et Rhizoma Notoginseng ,Folium Ginkgo and Radix Puerariae Lobatae were identified by TLC, and the content of total flavonol glyconsides in Extractum Ginkgo Siccuswas determined by HPLC, with Diamonsil C18 column was used, the Metharol-0.4% Phosphoric acid was used as a mobile phase and detecting wavelength at 360nm. RESULTS:Radix Et Rhizoma Notoginseng ,Folium Ginkgo and Radix Puerariae Lobatae identified by TLC were distinct and highly specific; QuercetinDaempfer and Isorhamnetin which were determined by HPLC were separated completely and had a good liner. CONCLUSION: The methods is reliable and reproducible. It can be used for the quality control of Tongtong GranuLe.
 

KEY WORDS HPLC, total flavonol glyconsides of Extractum Ginkgo Siccus, Radix et Rhizoma Notoginseng, Radix Puerariae Lobatae


      随着社会人群老龄化趋势的发展,缺血性脑病(中风)发病率都呈上升趋势1,2】1 仪器和材料。中药制剂在清除有氧自由基,改变血液流变状态和用于抗缺血再灌注等方面显示出较好效果【3】。在我院原协定处方基础上研制开发的医疗机构制剂酮通颗粒具有活血通络,祛瘀通脉的作用,临床应用疗效确切,为更好地控制该制剂质量,方便临床用药,对其进行质控实验研究,并建立起了该制剂的质量标准。
 
1.1 仪器 Mettler AE-241型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);515型高效液相色谱仪(美国Waters公司);C18柱(diamond 4.5㎜*250㎜);Model 500 labAlliance检测器(美国SSI公司);ANASTAR数据处理系统(美国SUNTEK公司);KQ-100D型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅有限公司);HHS-118型恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);
1.2 试药 槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品购自中国药品生物制品检定所批号分别为 100081-200406),110861-200606,110860-200407);银杏叶对照提取物、三七和葛根对照药材均购自中国药品生物制品检定所;酮通颗粒由我院制剂室制备。甲醇(色谱纯)天津市科密欧化学试剂有限公司,批号20070110;娃哈哈纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司出品,批号1222YS;硅胶G、硅胶H 青岛海洋化工有限公司。
2 方法和结果
2.1  薄层鉴别
2.1.1 三七 精密称取供试品3 g,加入数滴水浸润、搅匀,加以水饱和的正丁醇30 mL,超声30 min,放置2 h,离心,取上清液加30 mL的正丁醇饱和的水,摇匀放置使分层,取正丁醇层,蒸干;残渣加水溶解后用乙醚萃取2次(20 mL,20 mL),弃去乙醚液,水层溶液蒸干,残渣加甲醇5 mL溶解,作为供试品液;取三七对照药材0.5 g,加入70%乙醇15 mL超声30 min,过滤,滤液蒸去乙醇后加水溶解,用乙醚萃取2次(20 mL,20 mL),弃去乙醚,水层用正丁醇萃取2次(20 mL,20 mL),取正丁醇液蒸干,残渣加甲醇5 mL溶解作为对照药材液;按酮通颗粒制备工艺制得缺三七药材的样品同法制得阴性对照液。吸取上述3种溶液各3 µl分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂,上行展开10 cm,取出晾干,喷以10% H2SO4-乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰后,置365 nm紫外灯下检视。供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的颜色荧光斑点,而阴性对照液在此位置无干扰。(见图1)­­­
2.1.2 银杏叶4】 精密称取供试品2 g,加甲醇20 mL,加热回流10 min 放冷,滤过,滤液蒸干,加水20mL溶解,氯仿萃取2次(20 mL,20 mL),留水层蒸干,残渣加甲醇5mL溶解作为供试品溶液;取银杏叶对照提取物粉末0.5 g,加甲醇10 mL,加热回流,放冷滤过,溶液蒸干,加水10 mL溶解,氯仿萃取2次(10 mL,10 mL),保留水层,蒸干,残渣加甲醇溶解制得对照药材溶液;按酮通颗粒制备工艺制得缺银杏叶药材的样品,同法制备作为银杏叶阴性对照液。吸取上述3种溶液各6 µl,分别点于同一含4%醋酸钠的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(5:3:1:1)展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝乙酸溶液,热风吹干,置紫外光灯(365 nm)下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照药材无此斑点。(见图1)
2.1.3 葛根 称取供试品3 g,加甲醇30 mL,超声30 min,放置2 h,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2mL溶解作为供试品溶液;取葛根对照药材粉末0.5 g,加甲醇15 mL,超声30 min,放置2 h,取上清液蒸干,残渣加甲醇2 mL溶解作为葛根对照药材溶液;按处方比例制备缺葛根样品,同法制得葛根阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各10 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)为展开剂,展开,取出晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在于对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。(见图1)

1   2  3    4

 
1    2    3
1    2    3
                           

 

 
1 三七对照药材                  1 银杏阴性                         1葛根阴性
2 三七阴性                      2 槲皮素                           2对照药材
3 供试品                        3 银杏叶提取物                     3供试品
4 供试品
图1三七、银杏叶、葛根TLC(365 nm)
Graph 1 TLC of Radix et Rhizoma NotoginsengFolium Ginkgo andRadix Puerariae Lobatae
2.2 含量测定
酮通颗粒处方中的银杏叶总黄酮醇苷是药效的主要成分,其质量直接影响疗效,故选择测定银杏叶总黄酮苷含量来控制其内在质量。
2.2.1 供试溶液制备5,6】取供试品颗粒2 g,精密称定(约相当于银杏叶药材1 g),加甲醇-25%盐酸溶液(4:1)的混合液25 mL,置水浴中加热回流30 min,冷却至室温,转移至50 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;按酮通颗粒制备工艺制得缺三七药材的样品,同法制得阴性对照品液,再分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品2.62 mg、山奈素对照品2.28 mg、异鼠李素对照品1.24 mg于25 mL容量瓶中,加甲醇溶解稀释到刻度,制得混合对照品溶液。
2.2.2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:C18柱(diamond 4.5㎜*250㎜),流动相:甲醇-0.4% H3PO455:45),流速:1 mL·min-1,检测波长:360 nm,柱温:35℃,进样量20 μl,柱压<1200pa。理论塔板数按槲皮素峰计算不低于2500。在此色谱条件下,对照品槲皮素、山奈素、异鼠李素,酮通颗粒供试品和阴性样品的色谱图见图2。
槲皮素、山奈素和异鼠李素           银杏叶阴性                 供试品
2 酮通颗粒中银杏总黄酮HPLC图
Graph 4  Figures oftotal flavonoids of Folium GinkgoinTongtong GranuLe by HPLC
2.2.3        线性关系考察 按上述色谱条件,精密吸取上述对照品混合溶液0.5,1,2,4,6,8 mL置10 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度。注入液相色谱仪测得峰面积。以槲皮素、山奈素、异鼠李素浓度C为横坐标,峰面积A为纵坐标,制作槲皮素、山奈素和异鼠李素对照品的标准曲线图,并分别进行线性回归,计算出回归方程和线性范围,见表1。
1 总黄酮醇苷回归方程
Table 1 Regression equation of total flavonol glyconsides
对照品名称
回归方程
相关系数
线性范围
槲皮素
A=48128.6C-110750.5
r=0.9992
5.24~83.84 ug·mL-1
山奈素
A=41116.1C-70642.8
r=0.9991
4.56~72.96 ug·mL-1
异鼠李素
A=40353.33C-41386.7
r=0.9994
2.4839.68 ug·mL-1
2.2.4 精密度试验
精密吸取同一对照品溶液20 µL,连续进样6次,记录峰面积,结果峰面积的RSD值为槲皮素 1.21%、山柰素 0.83%、异鼠李素 1.63%。
2.2.5 稳定性试验
精密吸取同一对照品液和供试品液各20 µl,每间隔2小时进一针,连续考察8h,结果对照品峰面积的RSD分别为0.31%、0.72%、0.59%,供试品峰面积的RSD分别槲皮素1.68%、山柰素1.74%、异鼠李素1.92%。
2.2.6 重复性试验
取同一批供试样品,精密称取5份,按样品测定项下的方法测定,结果槲皮素的RSD为2.88%、山奈素的RSD为4.61%、异鼠李素的RSD为1.80%。
2.2.7 回收率试验
取已知含量的同一批样品适量,共5份,精密称定,分别精密加入槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品溶液各1 mL,按供试品液的制备方法,制成供试品溶液。照样品测定项下的方法测定,加样回收率分别为96.21%、99.14%和95.00%。
2.2.8   样品测定 
称取3份酮通颗粒,每份各2g,精密称定,同“2.2.1”项下方法操作制得供试品溶液,吸取同批号供试品溶液和槲皮素浓度为62.88 ug·mL-1,山奈素浓度为54.72 ug·mL-1,异鼠李素浓度为29.76 ug·mL-1的对照溶液各20 uL,依照2.2.2项下方法所述色谱条件测定,记录各峰面积,以外标法计算总黄酮醇苷含量。结果见表2。
总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51 。
2 样品总黄酮醇苷含量测定结果(3)
Table 2 the content of total flavonol glyconsides in sample (n=3)
序号
样品量(g)
总黄酮醇苷(mg)
平均含量
 1
2
1.9640
1.9637
2
2
1.9633
3
2
1.9638
3.    讨论
3.1 实验建立了酮通颗粒的质量标准,采用TLC对处方中银杏叶、三七、葛根进行了定性鉴别,采用HPLC建立了银杏叶总黄酮醇苷的含量测定,并经多批次检验,方法可行,结果重现性较好。
3.2 本制剂中银杏叶总黄酮醇苷是其主要药效成分,直接影响到治疗效果,故选择测定银杏叶总黄酮醇苷作为该制剂质量标准的含量测定方法。该标准的建立对于保证制剂质量,缩小制剂批间差异,确保临床疗效具有重要意义。
 
参考文献
[1] 李留霞.论缺血性脑中风的发病机理.光明中医,2007,22(5):14-15.
[2] 刘亚敏,徐秋英.中医药治疗缺血性中风的现状.长春中医医院学报,2002,18(2):57-58.
[3] 韩方璇,肖云彬,林慧.银杏叶提取物对糖尿病模型大鼠肾脏ET-1、TCF-β1的影响.中国药房,2008,19(27):2101-2103
[4]中药配方颗粒薄层色谱彩色图集.江苏科学技术出版社. 6、146.
[5]李彦博,孙静等.银杏叶中总黄酮醇苷的含量测定.中国实用医药,2008,3(6): 16-17.
[6]罗瑛,高秋芳.高效液相色谱法测定银杏磷脂胶囊中总黄酮醇苷的含量.中外健康文摘[临床医药版],2007,4(10):16-17.
 
 
 


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